Gitaroo Man erzählt die Geschichte eines Jungen namens U-1, dessen einziger Freund sein sprechender Hund Puma ist. Eines Tages erfährt U-1, dass einer seiner Vorfahren der legendäre Gitaroo Man war, ein intergalaktischer Superheld, der mit der Macht seiner Gitarre das Böse bekämpfte. Das erscheint auch bald in der Gestalt der üblen außerirdischen Gravillianer, die alle Gitarren im Universum stehlen, um die absolute Herrschaft an sich zu reißen. Und U-1 besitzt die letzte Gitarre, die die Gravillianer noch von ihrem Ziel trennt...

Mit Reaktionsvermögen, Geschicklichkeit und dem richtigen Taktgefühl ist es die Aufgabe des Spielers, zur richtigen Zeit die richtigen Töne anzuschlagen. Durch rechtzeitiges Drücken der Controllertasten und Drehen des Analogsticks gilt es, auch die härtesten Gegner mit rasanten Gitarrenriffs aus dem Takt zu bringen. Der Kampf besteht aus 3 Phasen, dem Lademodus, dem Gefechtsmodus und dem Finale. Im Gefechtsmodus werden abwechselnd Angriffs- und Verteidigungskombos ausgeführt. Per Drehung des Analogsticks wird die Richtung verfolgt, in die die Spielfigur im Takt den Kopf bewegen soll. Sie wird durch eine Linie vorgegeben. Mit der X-Taste wird an den markierten Punkten in die Saiten geschlagen. So wird das futuristische Instrument zunächst aufgeladen. Ein Energiebalken zeigt die eigene Energie sowie die Energie des Gegners an. Im Angriffsmodus schießen zusätzlich Blitze aus dem Gitarrenhals auf den Gegner.